骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是最常见的骨科疾病之一，在45岁以上人群中患病率约为26.6%[1]。OA最显著的病理改变是关节软骨的退变降解，这个过程主要由软骨和滑膜等组织产生的一系列软骨基质降解酶所介导[2] 。然而目前针对软骨基质降解酶开发的药物容易引发关节僵硬、炎症和疼痛等副作用，因而未能通过临床试验[3, 4]。成纤维细胞激活蛋白（Fibroblast activation protein，Fap）是一种丝氨酸蛋白酶，在活化的成纤维细胞中显著上调，在细胞外基质降解、肿瘤微环境形成、炎症和伤口愈合中起重要作用[5, 6]。在肌肉骨骼系统中，岳锐课题组的前期研究发现Fap在骨髓基质细胞和成骨细胞中高度表达，是一个新颖的成骨抑制因子[7] 。与之相反，骨凝集素（Osteolectin，Oln）能够与Fap相互作用并抑制其蛋白酶活性[7]，是一种成骨促进因子[8, 9]。有趣的是，在OA患者的滑膜中也能检测到Fap，尽管与类风湿关节炎(RA)患者相比，Fap水平较低[10, 11] 。Fap以及Fap/Oln相互作用是否参与调控OA进程仍不清楚。

2023年1月2日，同济大学生命科学与技术学院、附属东方医院再生医学研究所岳锐课题组联合同济大学附属东方医院关节与骨病专科尹峰课题组在Bone Research杂志（IF=13.4）在线发表了题为Inhibition of fibroblast activation protein ameliorates cartilage matrix degradation and osteoarthritis progression 的研究论文。该研究发现Fap在OA滑膜组织中显著上调，而其抑制因子Oln则在OA关节软骨表面显著下调。通过遗传学、药理学或注射重组Oln抑制Fap功能可以延缓OA进程，而通过遗传学敲除Oln则会加速OA进程。分子机制研究表明，Fap是软骨基质关键成分II型胶原（Type II Collagen，Col II）的新型降解酶，而Oln可以在关节软骨表面形成一层保护膜阻止软骨基质降解。总而言之，该研究揭示了Fap/Oln在调控关节软骨稳态中的重要作用，并为OA治疗提供了新靶点和新策略。

研究人员首先分析了Fap在人类滑膜组织中的表达。免疫荧光、qPCR和Western blot结果均显示，OA患者滑膜中FAP蛋白水平更高。与人类数据一致，Fap仅在假手术小鼠滑膜中被少量检测到，而在内侧半月板手术失稳后（DMM）的小鼠滑膜中显著上调。研究人员进一步对Fap敲除（Fap KO）和野生型对照小鼠进行DMM手术，术后3天开始每周膝关节腔内注射Fap选择性小分子抑制剂（FAPi）或PBS。DMM手术后的小鼠膝关节出现了明显的软骨侵蚀、软骨下骨增厚和滑膜炎，关节软骨中Col2a1的免疫荧光染色面积减少，而这些OA症状在Fap KO小鼠及FAPi小鼠中均得到显著改善。重要的是，FAPi在Fap KO小鼠中没有治疗作用，提示该抑制剂以Fap依赖的方式发挥作用。为了测试FAPi是否可以改善OA发生后的关节症状，研究人员在野生型小鼠中进行DMM手术，并等待4周后开始在关节内注射FAPi或PBS。FAPi治疗显著改善了DMM手术导致的小鼠OA症状（图2）。综合来看，这些数据表明Fap的基因敲除或药物抑制显著延缓了OA进程。 

图2. Fap的基因敲除或药物抑制显著延缓了小鼠OA进展

Fap参与许多疾病的细胞外基质重塑，如胰腺癌、心肌梗死和动脉粥样硬化，提示它可能在OA进展过程中发挥类似的作用[12-14]。研究人员发现重组Fap蛋白（rFap）能够以剂量和时间依赖性的方式降解变性的软骨基质主要成分Col II，该效应可被FAPi抑制。为了测试Fap的内源抑制剂Oln是否能抑制rFap降解变性Col II，研究人员在HEK293T细胞中过表达小鼠Fap（单独表达或与小鼠Oln一起表达），并对Fap进行免疫沉淀。免疫沉淀的Fap能够降解变性Col II，并其酶活可被Oln共表达部分抑制。进一步，研究人员检测了Fap是否具有与基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP）2/9类似的明胶酶活性，从而将MMP13切割的Col II降解为更小片段。实验结果显示重组人MMP13（rMMP13）可以将天然Col II消化成6个主要片段，其中55、40和30 kD片段可以被rFap进一步消化。在小鼠原代软骨细胞培液中加入rFap与rMMP13后，细胞总溶出物中Col2a1蛋白水平显著降低（图3）。这些数据表明Fap能够与MMP13协同工作，在体外降解Col II。研究人员进一步在OA发生后（DMM手术后4周）每周进行关节内注射rFap，发现rFap处理的小鼠关节软骨磨损、软骨下骨增厚和滑膜炎明显增加，小鼠关节软骨Col II显著减少。由此可见，Fap是一种新型的Col II降解酶。

图3. 在体外Fap能够与MMP13协同工作降解Col II

由于Oln是Fap的内源性抑制剂[7]，研究人员还分析了Oln是否参与调节OA进展。免疫荧光染色显示，Oln在正常人关节软骨浅层中高表达，但在OA患者的损伤软骨中几乎不表达，qPCR和western-blot同样证实了这一结果。研究人员还分析了Oln在小鼠膝关节中的定位，发现它在关节软骨和半月板浅层表达，并在DMM手术后显著下调。研究人员进一步对Oln KO、Oln/Fap KO和野生型对照小鼠进行了DMM手术。与DMM组小鼠相比，Oln KO小鼠表现出明显加重的OA表型，这些表型在Oln/Fap KO小鼠中得到显著改善，提示Oln以Fap依赖的方式改善OA进展（图4）。此外，关节内注射rOln也可以显著减缓OA进展。

图4. Oln以Fap依赖的方式改善小鼠OA进展

研究模式图

同济大学岳锐教授与尹峰教授为本文的共同通讯作者，博士研究生范骜元和吴亘彬为本文的共同第一作者。岳锐教授实验室常年招收研究生、博士后与科研助理，欢迎访问实验室网页了解详细信息：https://life.tongji.edu.cn/03/11/c12618a131857/page.htm。

1. Turkiewicz, A., et al., Current and future impact of osteoarthritis on health care: a population-based study with projections to year 2032. Osteoarthritis Cartilage, 2014. 22(11): p. 1826-32.
   

2. Pap, T. and A. Korb-Pap, Cartilage damage in osteoarthritis and rheumatoid arthritis--two unequal siblings. Nat Rev Rheumatol, 2015. 11(10): p. 606-15.

3. Renkiewicz, R., et al., Broad-spectrum matrix metalloproteinase inhibitor marimastat-induced musculoskeletal side effects in rats. Arthritis Rheum, 2003. 48(6): p. 1742-9.

4. Krzeski, P., et al., Development of musculoskeletal toxicity without clear benefit after administration of PG-116800, a matrix metalloproteinase inhibitor, to patients with knee osteoarthritis: a randomized, 12-month, double-blind, placebo-controlled study. Arthritis Res Ther, 2007. 9(5): p. R109.

5. Rettig, W.J., et al., Cell-surface glycoproteins of human sarcomas: differential expression in normal and malignant tissues and cultured cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 1988. 85(9): p. 3110-4.

6. Kou, X., et al., The Fas/Fap-1/Cav-1 complex regulates IL-1RA secretion in mesenchymal stem cells to accelerate wound healing. Sci Transl Med, 2018. 10(432): p. eaai8524.

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8. Yue, R., B. Shen, and S.J. Morrison, Clec11a/osteolectin is an osteogenic growth factor that promotes the maintenance of the adult skeleton. Elife, 2016. 5: p. e18782.

9. Shen, B., et al., Integrin alpha11 is an Osteolectin receptor and is required for the maintenance of adult skeletal bone mass. Elife, 2019. 8: p. e42274.

10. Bauer, S., et al., Fibroblast activation protein is expressed by rheumatoid myofibroblast-like synoviocytes. Arthritis Res Ther, 2006. 8(6): p. R171.

11. Waldele, S., et al., Deficiency of fibroblast activation protein alpha ameliorates cartilage destruction in inflammatory destructive arthritis. Arthritis Res Ther, 2015. 17: p. 12.

12. Lee, H.O., et al., FAP-overexpressing fibroblasts produce an extracellular matrix that enhances invasive velocity and directionality of pancreatic cancer cells. BMC Cancer, 2011. 11: p. 245.

13. Nagaraju, C.K., et al., Global fibroblast activation throughout the left ventricle but localized fibrosis after myocardial infarction. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 10801.

14. Brokopp, C.E., et al., Fibroblast activation protein is induced by inflammation and degrades type I collagen in thin-cap fibroatheromata. Eur Heart J, 2011. 32(21): p. 2713-22.