由于多能干细胞衍生的心肌细胞（induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes，iPSC-CMs），不完全具备成熟心肌细胞的特质，从而限制了其细胞治疗、药物筛选等临床应用[1,2]。而围产期是心肌细胞成熟的关键转变窗口，和心肌细胞谱系决定一样，受到转录调控程序的精密控制[3,4]。因此，深度阐明心肌细胞在围产期精准调控程序的转变对理解心肌细胞成熟意义重大，并有助于优化iPSC-CMs的工程方法，制备有功能的心肌细胞应用于临床。

2023年1月18日，南京大学医学院杨敬平研究组与同济大学生命科学与技术学院魏珂研究组合作在国际学术期刊Cell Death Discovery发表了题为“Dynamic chromatin landscape encodes programs for perinatal transition of cardiomyocytes”的研究。该研究对心肌细胞在短暂的围产期窗口进行了精细的基因组调控程序解析，通过染色质可及性、基因表达和三维基因组等多层信息的动态图谱，揭示了动态变化的调控元件活性和较稳定的染色质三维结构在围产期表型重编程中的作用，并确定了转录因子MEF2和AP1家族成员协调围产期心肌细胞转变程序，其调控网络的重编译可促进iPSC-CMs表现出成人心肌细胞样的电生理表现。

图1：围产期心肌细胞染色质的动态转录调控机制

为了解心肌细胞在围产期转变所涉及的调控程序，作者从小鼠中分离了围产期四个时间点的心肌细胞：胚胎期第18.5天 (E18.5)、出生后第1天（P1）、第3天（P3）与第7天（P7），首先通过ATAC-seq和RNA-seq分析了围产期心肌染色质可及性和基因表达情况（图2A）。作者鉴定了心肌细胞全基因组63436个可及性区域，其中19560个显示出在围产期的染色质可及性差异（图2B）。启动子染色质可及性的动态变化伴随着基因表达的改变，但非启动子调控元件活性与最近的基因表达水平相关性非常弱（图2C）。为了进一步全面了解动态元件的调控作用，作者使用H3K27ac的HiChIP实验，在E18.5和P3的HiChIP数据10kb的分辨率下捕获了14712个染色质相互作用，4361个是与启动子有关的互作（图2D-E）。与远端可及元件相互作用的基因显示出显著更高的表达（图2F）。这些结果表明染色质一维与三维结构协调了一个对围产期心肌细胞至关重要的转录调控网络。

图2 围产期心肌细胞转录调控网络的构建

染色质三维结构在心肌细胞谱系决定中高度重组[5]，但在围产期窗口是否变化尚不清楚。作者的研究结果显示仅6.3%的相互作用在出生后减弱或增强，并协调基因表达的改变（图3A-C）。对于大部分不存在高度动态的染色质相互作用，其涉及的调控元件可及性改变同样与靶基因的转录水平相关（图3D-F）。因此，在围产期心肌细胞中，预先建立的染色质高阶结构为差异可及的调控元件提供了平台，通过元件活性的升高与降低以指导基因转录。

图3 染色质相互作用介导围产期心肌细胞转录变化

鉴于转录因子对染色质功能的重要性，作者寻找了与围产期心肌细胞重编程相关的关键转录因子，并揭示了MEF2和AP1分别介导了出生后活性下降与上升的转录调控（图4A-C）。为了检验建立的调控程序在心肌细胞围产期转变中的作用，作者在分离的新生大鼠心室心肌细胞(NRVCs)中操纵了鉴定的转录因子活性，结果显示出生后MEF2的异常激活会损害心肌健康（图4D-E），并证实了AP1对出生后心肌细胞增殖的负调控作用（图4F-G）。

图4 围产期动态调控程序受到转录因子MEF2和AP1调节

体外iPSC-CMs表现出不完全成熟的特性，作者试图利用围产期调控机制来促进iPSC-CMs的成熟。作者的研究发现iPSC-CMs中MEF2A的抑制导致了与电生理异常相关基因表达降低，并显著增加了Ca2+瞬态的振幅(图5A-E)。此外，MEF2A抑制的iPSC-CMs与成年心肌细胞样本的总体相关性显著增强(图5F)。这些结果表明，MEF2A的调控可以诱导iPSC-CMs更像体内的成熟心肌细胞，这将有助于心血管研究领域的发展。

图5 MEF2调控程序的重新编译提高了iPSC-CMs的成熟度

综上所述，该研究基于围产期心肌细胞的染色质可及性、远程染色质相互作用和基因表达，揭示了心肌细胞的围产期转变受到转录调控的严格控制，包括转录因子、一维到三维染色质结构，为心肌细胞围产期重编程提供了全面的调控资源。该研究同时发现，关键的转录因子MEF2和AP1对于染色质结构中调控元件在围产期的重塑至关重要。尽管MEF2是心肌细胞身份识别所必需的，但该研究表明出生后为维持心肌细胞的健康，MEF2在某些调控元件上的调控活性被下调，且MEF2调控程序的重新编译在提高iPSC-CMs成熟度中起着重要作用(图6)。这一发现为产生有功能的心肌细胞用于临床提供了潜在途径，需后续研究进一步证明。未来的研究需要整合多种促进体外心肌细胞成熟的方式，帮助研究者们实现iPSC-CMs的全面成熟。

图6 围产期心肌细胞的转录调控机制

本研究的共同第一作者为南京大学医学院博士生张静和同济大学生命科学与技术学院博士生欧阳兆惠。同济大学生命科学与技术学院魏珂教授、南京大学医学院杨敬平副教授、李朝军教授、施少林教授为本文的共同通讯作者。该研究得到了国家科技部重点研发计划项目、国家自然科学基金项目、南京大学与埃默里大学合作研究基金、江苏省科技资源（临床资源）协调服务平台开放项目及江苏省研究生科研实践创新计划项目的支持。

文献引用：

[1] H. Uosaki et al., Transcriptional Landscape of Cardiomyocyte Maturation. Cell Rep 13, 1705-1716 (2015).

[2] Y. Guo et al., Cardiomyocyte Maturation: New Phase in Development. Circ Res 126, 1086-1106 (2020).

[3] S. Kannan, et al., Regulation of cardiomyocyte maturation during critical perinatal window. J Physiol-London 598, 2941-2956 (2020).

[4] G. Jia et al., Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nat Commun 9, 4877 (2018).

[5] Y. Zhang et al., Transcriptionally active HERV-H retrotransposons demarcate topologically associating domains in human pluripotent stem cells. Nat Genet 51, 1380-1388 (2019).