近日，同济大学附属上海市肺科医院张鹏团队联合同济大学生命科学与技术学院王晨飞团队，同济大学医学院孙毅团队与中科院生化细胞所曾安团队，于Nature Genetics 杂志在线发表题为Multi-omic profiling highlights factors associated with resistance to immuno-chemotherapy in non-small cell lung cancer的研究论文。该研究利用空间转录组，单细胞转录组及bulk转录组测序（spatial transcriptomics, single-cell and bulk RNA-seq）、以及多色荧光染色系统刻画NSCLC的TME在新辅助免疫治疗中的动态变化，鉴定出新的生物标志物以及潜在的耐药的新机制。

在该研究中，研究者收集了19例NSCLC新辅助免疫治疗前后的原发肿瘤样本进行空间转录组（10X Visium，Nanostring GeoMx DSP），scRNA-seq和bulk RNA-seq。对单细胞转录组的数据质控后总共获得232,080个高质量单细胞，聚类后分为上皮细胞、T细胞、B细胞、髓系细胞等。作者首先对鉴定出的癌细胞进行了系统的生物信息学数据分析，揭示了非小细胞肺癌中肿瘤细胞的显著异质性，发现其中两种肿瘤细胞状态分别与免疫治疗的响应与耐药相关。

研究者接下来对肿瘤微环境进行了探索。针对10X Visium的空间转录组数据，研究者利用STRIDE算法推算出所有spot中的细胞比例后进行聚类，获得了15个肿瘤生态位。其中，每个生态位都有其高富集的细胞类型。研究者发现一些生态位具有特别的空间特征，比如高富集COL11A1+ CAF的生态位在空间上包裹着高富集肿瘤细胞的生态位，以及高富集B细胞和T细胞的生态位在空间上与H&E染色中的淋巴聚集区域相对应。 

于是，研究者基于细胞生态位的空间特征进行了进一步分析。研究者发现了COL11A1+ 肿瘤相关成纤维细胞（CAF）的比例在治疗非响应的患者中显著高于治疗响应的患者。治疗前肿瘤样本的空间转录组数据显示，肿瘤边界的COL11A1+ CAF的比例在非应答组中显著高于应答组，CD8+T细胞的比例在非应答组中显著低于应答组，提示COL11A1+ CAF在肿瘤边界形成屏障潜在阻碍T细胞浸润。细胞互作分析发现肿瘤细胞和COL11A1+ CAF可以通过DDR1-collagen轴相互作用。 多重免疫荧光实验显示COL11A1+ CAF将DDR1+肿瘤细胞包裹。治疗后样本的空间转录组数据和外部数据进一步显示COL11A1+CAF与CD8+T细胞在肿瘤微环境中呈反比关系。外部队列显示COL11A1+ CAF的比例与免疫治疗人群的临床结局显著相关。另外，研究者发现SPP1+巨噬细胞与COL11A1+CAF 的比例呈显著正相关。和COL11A1+CAF 一致，在治疗非响应的患者中显著高于治疗响应的患者。多重免疫荧光实验证实COL11A1+CAF和SPP1+巨噬细胞的在肿瘤边界的共定位，阻碍了T细胞的浸润。 

针对高富集B细胞和T细胞的生态位，研究者发现这些生态位所在的区域与三级淋巴结构（TLS，Tertiary lymphoid structures）高度相关。于是研究者基于图像和转录组特征，开发了针对空间转录组学数据的TLS识别算法Space Scanner。利用该算法，自动识别出空间转录组队列中的TLS，利用降维聚类将所有TLS划分为4类：Lymphoid Aggregates，Activated TLS，Declining TLS和Late TLS。4类TLS代表TLS的不同成熟阶段，其中Activated TLS代表成熟的TLS阶段。研究者观察到late TLS 在pCR（病理完全缓解）和NMPR（未达到主要病理缓解）患者中都有分布，对两组late TLS进行差异分析后发现，NMPR组的TLS在缺氧相关通路中富集。Activated TLS的缺氧评分显著低于其他阶段TLS。分析外部独立队列显示缺氧评分与Activated TLS的评分负相关，提示缺氧可能与抑制TLS的成熟相关。同时，外部数据显示Activated TLS评分与更好的临床结果相关。

综上，本文利用非小细胞肺癌免疫治疗前后的肿瘤样本，通过多组学测序和多重免疫荧光实验系统地揭示了非小细胞肺癌免疫联合化疗耐药的因素，为后续肺癌免疫治疗研究提供了珍贵的数据支持。 

同济大学附属上海市肺科医院张鹏教授，同济大学生命科学与技术学院王晨飞教授，同济大学医学院孙毅教授、肺科医院张乐乐副研究员和中科院生化细胞所曾安研究员为该论文共同通讯作者，同济大学附属上海市肺科医院严以律博士后，同济大学生命科学与技术学院孙冬青博士，肺科医院胡俊杰博士研究生，中科院生化细胞所陈悦博士为共同第一作者。