人胆管树干细胞（biliary tree stem cells, BTSCs）是位于肝内、肝外和胰外胆管树壁内胆管周腺（peribiliary tree glands, PBG）内的干细胞龛中的肝/胰腺共祖干细胞。在器官发育和再生过程中，BTSCs可产生多种干细胞亚群，一方面通过向位于赫林管内或附近肝干细胞（hepatic stem cells, HpSCs）及其后代肝母细胞（hepatoblast, HBs）分化介导肝再生。另一方面，通过分化为位于肝/胰腺总导管的PBG的胰腺干细胞介导胰腺再生。

早期印度开展的一项临床试验表明，移植从胎儿肝脏中分离出的HpSCs和HBs的混合物可以挽救80%以上的终末期肝病患者，这与接受标准疗法并在半年至一年内死亡的患者相比，可提供至少两年的生存期。而另一项意大利的临床试验发现，移植胎儿来源的BTSCs同样可以有效救治患者。且由于其低免疫原性，受试者移植后在无免疫抑制剂使用的情况下，在随访的一年内，未发现免疫排斥反应。因此，证实BTSCs在肝脏和胰腺功能损伤修复中具有重大应用前景。然而，实现BTSCs的临床应用尚需解决三个关键问题：其一，BTSCs获取和扩增；其二，BTSCs移植定植效率；其三、BTSCs移植后功能成熟和命运转归。

2024年9月11日，同济大学生命科学与技术学院/东方医院何志颖教授、张文成副研究员团队与美国北卡罗来纳大学教堂山分校（UNC-CH）Lola Reid教授团队在《Bioactive Materials》上发表题为“Hormonally and Chemically Defined Expansion Conditions for Organoids of Biliary Tree Stem Cells”的研究论文。该研究建立了一个完整定义的BTSC类器官扩增体系，该体系通过分析确定BTSC类器官体外扩增微环境的必须组分，建立了名为BTSC水凝胶扩增体系（Biliary tree stem cell expansion hydrogel system, BEX），成功地实现了对BTSCs及其类器官成千倍的扩增。扩增后的BTSCs及其类器官不但在体外可分化为功能性肝细胞。在体内，通过项目组前期建立的干细胞补片移植，可有效救治肝衰竭小鼠。该体系的建立，为BTSCs的临床应用制备充足数量和完整功能的种子细胞提供理想体系。

为了明确BTSCs的候选有丝分裂原，本研究通过比较BTSC与成熟肝实质细胞的转录组图谱，确定BTSCs干性维持的关键信号通路（如Hippo、PI3K/AKT、MAPK和Ras信号通路）。通过结合研究团队前期对胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES）和胃上皮细胞来源的内胚层干细胞的研究，确定了包括0.5μM Bix01294、2μM Bay K8644、0.04μM RG108、2μM SB431542、10μM毛喉素和1μM A83-01等小分子化合物，与50 ng/mL EGF、100 ng/mL R-Spondin1（RSPO1）、100 ng/mL Noggin和50 ng/mL Wnt3a等生长因子或旁分泌信号组合构成10因子-确定增殖培养基（10-Defined-Proliferative-Medium, 10-DPM），成功地实现了原代BTSCs的扩增（7天，20倍扩增）。后续研究发现，该10-DPM不但可以有效维持BTSCs的传代扩增，而且在结合水凝胶（Matrigel或者透明质酸-肝素水凝胶）的三维扩增体系下，可以获得BTSC类器官，并实现BTSC类器官的长期扩增传代。

对于10-DPM展开组合优化筛选结果证实，在所有的小分子化合物中，DNA甲基化酶抑制剂RG108、TGFβ信号通路抑制剂A83-01、cAMP激动剂毛喉素、钙离子通道激动剂Bay K8644组成的4-DPM是原代BTSCs扩增的必须组分。然而，在缺乏Wnt信号通路的激活配体RSPO1的情况下，BTSCs的传代和类器官的形成和持续传代能力受到了明显影响。而添加RSPO1组成的5-DPM可以发挥与10-DPM相当的促进原代BTSCs增殖、BTSCs二维扩增和BTSC类器官形成和长期扩增维持的能力，因此证实了Wnt信号通路在BTSCs扩增和BTSC类器官形成中扮演的关键角色。

比较二维条件，基于水凝胶的三维扩增体系展现出了明显的优势。在5-DPM作为扩增培养基的情况下，水凝胶预处理的二维体系仅能在有限代次内维持BTSCs属性。相比之下，BTSC类器官可在5-DPM条件下，稳定传代20代以上，实现在60天内完成3000倍以上的细胞扩增。通过对二维和三维条件下扩增的BTSCs的转录组图谱进行比较分析，结果发现，三维扩增体系可以最大限度地减少细胞增殖过程中产生的DNA损伤，从而为细胞提供二维单层培养中所缺乏的损伤保护。

在确认了培养基后，该研究进一步对水凝胶的成分进行了优化。与其他三维培养扩增研究相似，本研究中首先借鉴了Hans Clevers等团队基于Matrigel的类器官形成和维持体系。Matrigel（康宁）主要由四种主要的基底膜成分组成，包括层粘连蛋白（约60%）、IV型胶原（约30%）、巢蛋白（约8%）和硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPGs）尤其串珠蛋白（约2-3%）。其他组分的生物学活性已经有大量研究，但其独立于蛋白多糖的GAG尚未确定。通过结合BTSCs体内微环境中的糖胺聚糖组分，通过在透明质酸水凝胶中添加硫酸乙酰肝素及其蛋白多糖组分（HAHS），成功地实现对Matrigel的替代。并最终与5-DPM结合，形成成分确定的BTSCs类器官体外扩增的BEX体系。

本研究建立了BEX体系，实现了BTSCs及其类器官的体外大量扩增，扩增后的BTSCs具有肝向分化和救治肝衰竭模型的能力，为推动基于BTSCs移植救治肝衰竭的临床转化应用提供稳定种子细胞制备体系。

何志颖教授、张文成副研究员和美国北卡罗来纳大学教堂山分校Lola Reid教授为本文通讯作者，锦州医科大学硕士研究生崔洋洋、路梦琦、同济大学生科院徐茗扬、李玉婷为共同第一作者。该研究获得国家科技部重点专项、国家自然基金委及上海市科委等项目的资助。