2018年1月25日，同济大学生命科学与技术学院高绍荣教授课题组与江赐忠教授课题组合作在Cell系列《Stem Cell Reports》杂志在线发表了题为“Reduced self-diploidization and improved survival of semi-cloned mice produced from androgenetic haploid embryonic stem cells through overexpression of Dnmt3b”的研究论文。研究工作揭示了Dnmt3b能恢复孤雄单倍体胚胎干细胞全基因组甲基化水平，延缓单倍体细胞的自发二倍体化，并提高半克隆小鼠发育潜能及存活能力。
       孤雄单倍体胚胎干细胞（AG-haESCs）是指只具有一套来源于精子基因组的胚胎建立的一类特殊胚胎干细胞。由于其没有母源的基因组，因此只具有20条染色体，并保留了部分雄性基因组的印迹特征，能够替代精子使成熟卵母细胞受精，进而发育成为完整的小鼠，该小鼠也称为半克隆小鼠（SC mice）。因此，孤雄单倍体胚胎干细胞在隐性遗传基因筛选，基因功能研究和模式动物制作等方面具有重要的应用价值。但是，孤雄单倍体胚胎干细胞在培养过程中，会快速发生二倍体化，从而变成一类特殊的孤雄二倍体胚胎干细胞。此外，其制作半克隆小鼠的效率仅为0%-5%，且存活的半克隆小鼠中也只有约50%的小鼠正常发育至成年时期，这些缺陷极大的限制了AG-haESCs在科学研究中的广泛应用。
       高绍荣课题组在本项研究中，建立了来源于两种基因型背景共6株孤雄单倍体胚胎干细胞系，并通过多种手段验证了其多能性和分化潜能。通过RNA-seq等方法，研究发现孤雄单倍体与传统胚胎干细胞相比，其从头甲基化酶Dnmt3b以及辅助甲基化的Trim28,Pcna等基因都出现了低表达。此外，定量质谱测序也进一步揭示了，该类细胞的全基因组甲基化（5mC）水平显著低于二倍体胚胎干细胞。利用重亚硫酸盐测序（Bisulfite sequencing）等方法，研究进一步明确了低甲基化主要存在于基因组的重复序列major satellite repeats 、minor satellite repeats、Line-1、IAP和一些印记基因(H19、Gtl2)的差异甲基化（DMR）区域。在AG-haESCs中过表达Dnmt3b，可显著提高细胞全基因组甲基化的水平，部分恢复重复序列的甲基化状态。同时，甲基化的恢复，还调控了特定细胞周期基因的表达，从而很大程度上抑制了细胞培养过程中二倍体化的发生。此外，研究中还联合利用CRISPR/Cas9和RNAi技术，证明了从头甲基化酶在孤雄单倍体胚胎早期发育以及建系等方面发挥重要作用。在进行体内发育检测，制作半克隆小鼠的过程中，研究发现野生型AG-haESCs中Dnmt3b的过表达，可以提高半克隆胚胎囊胚发育率和移植后的着床率。在DKO AG-haESCs中过表达Dnmt3b，可使得出生后半克隆小鼠存活到成年的比率从50%提高到了90%。

       同济大学高绍荣教授课题组的博士生何文腾和江赐忠教授课题组的张小白助理教授为本文共同第一作者，陈嘉瑜副教授、高绍荣教授和江赐忠教授为本文的共同通讯作者。参与此项研究工作的还有：张亚林、郑炜圣、熊泽宇、胡欣洁、王明珠、张林凤、赵堃、乔志斌、寇晓晨、赵艳红、赖玮毅力、吕聪、陈墨、徐睿敏、刘文强副研究员、李翀副研究员、王红老师等。该项研究还得到了中国科学院生态环境研究中心汪海林课题组的大力帮助。本文的模式图及文章插画由金铃绘制，在此深表感谢。本项目得到了国家自然科学基金委、科技部干细胞及转化研究重点研发计划、上海市科委以及上海市教委项目的资助。

全文链接：Stem Cell Reports-He.pdf